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關于植物RNA提取試劑盒優化升級的說明

發布日期：2020/2/25 10:25:08
   
    最新研發改良的植物RNA強力裂解液HL，適用性非常廣泛，可以從多種植物組織（包括多糖多酚型）、真菌、一些細菌、一些酵母中成功提取高質量RNA（用于細菌、酵母的RNA提取均有客戶案例，例如山東省農科院某課題組使用某廠家酵母RNA提取試劑盒提取酵母RNA失敗，轉而使用諾貝萊RNE35廣譜型植物RNA提取試劑盒成功提取）。
   
    諾貝萊植物RNA提取試劑盒共有三款，分別是“RNE31植物RNA快速提取試劑盒”，“RNE35廣譜型植物RNA提取試劑盒（DNase I）”，“RNE33多糖多酚植物RNA提取試劑盒（gDNA清除柱）”，他們均配備強力裂解液HL，相同的裂解純化系統（最高RNA得率超過70 μg）；區別在于去除DNA殘留的方式不一樣，如下表：
 

Flyingshark?植物RNA提取系列

去除DNA方式

提取時間min

下游實驗

RNE31植物RNA快速提取試劑盒

不去除

10-15

用于對DNA殘留不敏感的實驗或者去除DNA后用于所有RNA實驗

RNE35廣譜型植物RNA提取試劑盒（DNase I）

DNase I

30-40

直接用于所有RNA實驗

RNE33多糖多酚植物RNA提取試劑盒（gDNA清除柱）

gDNA清除柱

15-20

直接用于所有RNA實驗
 
    以實驗案例做具體解釋。分別以上述三款試劑盒提取80 mg新鮮小麥葉片RNA，每組兩次重復，50 μl RNase-free H2O洗脫，RNA溶液做兩倍稀釋后取1 μl進行瓊脂糖凝膠電泳（125 V，25 min），電泳圖譜如下：


   
    通過電泳圖可以直觀對比三款試劑盒的提取效果：電泳條帶全部清晰明亮無降解，RNE31存在少量的DNA殘留，RNE35和33均無明顯DNA污染。以超微量核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度，結果如下表：
 

貨號

濃度（ng/μl）

OD260/280

OD260/230

RNE31

1107

2.06

2.06

1030

2.03

2.02

RNE35 (DNase I)

970

2.04

2.02

952

2.06

2.04

RNE33 (gDNA清除柱)

876

2.05

2.04

874

2.04

2.02
 
       
        RNE31得率在50 μg以上，RNE35得率在45 μg以上，RNE33得率在40 μg以上。
    除此之外，RNE31和RNE35還增加了過濾柱套件（Filter Columns FS）用于過濾去除裂解上清中可能殘留的組織碎片，更能確保RNA純度的穩定性。

附錄1

    最新強力裂解液HL是在老款HL裂解液基礎上，經過科學的優化配方配比改良而來，提高了裂解液的裂解能力和提取的靈敏度。試劑盒中所有溶液全部采用進口分子生物學級生化試劑配制，輔以先進的配制工藝確保不同批次間穩定性極佳。

    使用RNE35廣譜型植物RNA提取試劑盒（DNase I）提取80 mg連翹葉片，每組兩次重復，50 μl RNase-free H2O洗脫，RNA溶液做兩倍稀釋后取1 μl進行瓊脂糖凝膠電泳（125 V，25 min），電泳圖譜如下：


   
   電泳條帶清晰明亮無降解，無DNA殘留。測定RNA濃度如下表：
 

 

濃度（ng/μl）

OD260/280

OD260/230

升級后

990

2.07

2.04

1011

2.06

2.07

升級前

906

2.04

2.08

888

2.03

2.07
   
    簡單測算升級后濃度提高~23%。
   
    使用RNE35廣譜型植物RNA提取試劑盒（DNase I）提取80 mg夏至草葉片，每組兩次重復，50 μl RNase-free H2O洗脫，RNA溶液做五倍稀釋后取1 μl進行瓊脂糖凝膠電泳（125 V，25 min），電泳圖譜如下：


   
    電泳條帶清晰明亮無降解，無DNA殘留。測定RNA濃度如下表：

 

濃度（ng/μl）

OD260/280

OD260/230

升級后

1466

2.02

2.04

1489

2.06

2.11

升級前

1167

2.08

2.03

1144

2.04

2.01
       
    簡單測算升級后濃度提高~28%。
 

附錄2

        DNase I是一種需二價陽離子的脫氧核糖核酸內切酶，可用于降解單鏈或雙鏈DNA。用于不含DNA的RNA制備，去除體外轉錄之后的模板DNA，在RT-PCR及RT-qPCR反應前制備不含DNA的RNA等實驗。

    諾貝萊生物配制的DNase I（貨號RNE36），無RNase污染，高效特異消化殘留的DNA，兼容所有離心柱式RNA提取試劑盒。柱上消化效果如下述電泳圖：



附錄3

1.       電泳圖顯示28 S條帶暗，18 S亮，就一定是RNA降解嗎？

實際上，RNA跑瓊脂糖電泳是一個比較方便但并不特別嚴格的檢測RNA質量的手段，當RNA上樣量過高，或膠中染色劑濃度較低時會出現過載現象，導致28 S沒有被染色劑飽和，此時可以嘗試降低RNA上樣量或直接提高染色劑濃度。

    下圖展示的是一個RNA上樣過載導致28 S比18 S暗的例子，當對RNA做適當稀釋，減少上樣量后，28 S恢復正常顯色。

   
     
    如何判斷是降解還是上樣過載呢？觀察上圖紅色箭頭指示的條帶兩端，兩端亮中間暗，則大概率上是染色劑缺失造成的28 S未被飽和。